Capturer comment les enzymes ARN polymérase lancent la transcription – –

À des échelles trop petites pour que nos yeux puissent les voir, les affaires de la vie passent par la fabrication de protéines, qui confèrent à nos cellules à la fois structure et fonction. Les protéines cellulaires obtiennent leurs ordres de marche à partir d’instructions génétiques codées dans l’ADN, dont les séquences sont d’abord copiées et transformées en ARN dans un processus en plusieurs étapes appelé transcription.

Une collaboration de recherche à la Colorado State University se spécialise dans la microscopie à fluorescence haute résolution et la modélisation informatique pour visualiser et décrire ces processus de vie avec des détails exquis, en temps réel, au niveau de gènes uniques. Désormais, des scientifiques dirigés par la chercheuse postdoctorale Linda Forero-Quintero ont, pour la première fois, observé la dynamique précoce de la transcription de l’ARN en enregistrant où, quand et comment les enzymes ARN polymérase déclenchent la transcription en se liant à une séquence d’ADN.

La technologie révolutionnaire, détaillée dans le journal Communications de la nature, a d’innombrables retombées possibles; il s’agit notamment de mieux comprendre les processus biologiques de base, de dévoiler les fondements génétiques de certaines maladies.

«C’est la première fois que quelqu’un examine la dynamique de phosphorylation de l’ARN polymérase dans un gène à copie unique», a déclaré Forero, chercheur postdoctoral co-dirigé par Tim Stasevich, professeur Monfort et professeur agrégé en biochimie, et Brian Munsky, associé professeur en génie chimique et biologique. Dans le passé, une telle activité de transcription précoce ne pouvait être visualisée qu’en utilisant des tableaux de gènes, qui sont des structures artificielles composées de centaines de copies d’un gène et rarement trouvées dans le noyau cellulaire.

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Stasevich et Munsky mènent une collaboration financée par la Fondation WM Keck et l’Institut national des sciences médicales générales (par le biais de deux prix Maximizing Investigators ‘Research Awards) qui cherche à dévoiler et quantifier l’expression génétique en temps réel dans des cellules uniques vivantes. Forero, qui travaille dans les deux laboratoires sous les auspices de la collaboration, avait précédemment étudié les protéines et les transporteurs dans les membranes cellulaires associés à des conditions neurologiques.

Activité de transcription précoce

Comme décrit dans Communications de la nature, Forero et coll. a conçu une méthode utilisant une lignée cellulaire de mammifère établie, des fragments d’anticorps fluorescents et un microscope à super résolution personnalisé pour capturer le processus de transcription précoce dans des couleurs vives: bleu, vert et rouge. Plus précisément, ils ont observé le début du cycle de transcription qui se produit lorsque l’enzyme de transcription ARN polymérase II (RNAP2) devient phosphorylée, ou décorée avec des groupes phosphate, sur sa queue d’acide aminé.

“La science interdisciplinaire est ici un mélange fantastique de nouvelles capacités expérimentales et d’une nouvelle approche pour la modélisation informatique mécaniste de la dynamique unicellulaire, qui sont toutes deux très nouvelles dans leurs domaines respectifs”, a déclaré Munsky, qui supervise les aspects informatiques de la collaboration. .

Au laboratoire, les chercheurs ont chargé leurs fragments d’anticorps dans une lignée cellulaire de mammifère établie contenant un gène rapporteur qui, une fois transcrit, est éclairé par une protéine marquée par fluorescence. Les fragments d’anticorps, que Stasevich a aidé à développer il y a plusieurs années, sont marqués avec des molécules fluorescentes qui éclairent leurs cibles spécifiques dans la queue RNAP2. En utilisant ces technologies de marquage ensemble, les chercheurs ont pu distinguer trois étapes distinctes dans le cycle de transcription, marquées par des couleurs différentes. Les images obtenues avec ce système se traduisent par une fluctuation d’intensité de fluorescence. Les chercheurs ont ensuite utilisé ces signaux pour interpréter l’organisation spatio-temporelle de la phosphorylation de RNAP2 tout au long du cycle de transcription au niveau d’un gène à copie unique.

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Nouvelles informations via le modèle de calcul

L’équipe de Munsky dirigée par l’étudiant diplômé William Raymond a pris les données microscopiques de Forero et Stasevich et les a traduites en un modèle de calcul basé sur des équations différentielles stochastiques. En adaptant ce modèle statistique pour reproduire tous les résultats expérimentaux, l’équipe de calcul a ensuite étendu ses analyses pour glaner de nouvelles informations mécanistes et quantitatives sur les différentes molécules et leurs états à travers le processus de transcription.

Par exemple, ils ont estimé combien de molécules d’ARN polymérase individuelles se rassemblent pour former des grappes transitoires dans la région du promoteur de l’ADN, combien de temps ces grappes persistent et comment, quand et où les polymérases se répartissent le long de l’ADN. Ils ont découvert, par exemple, que chaque sursaut d’activité de transcription produit un amas entre cinq et 40 ARN polymérases à former autour de la région promotrice du gène, dont 46% réussissent finalement à transcrire l’ARN. Ils ont également constaté que chaque ARN prend environ cinq minutes pour être entièrement transcrit et traité avant la libération.

Forero affirme que la technologie a un potentiel considérable, en particulier combinée avec des technologies plus récentes comme CRISPR, dans lesquelles des gènes spécifiques peuvent être distingués et manipulés. Le choix d’un certain gène d’intérêt, par exemple celui impliqué dans une maladie, et l’application de la lecture en temps réel du cycle de transcription par les chercheurs de la CSU, pourraient alors permettre aux chercheurs d’observer les processus pathologiques se déroulant au niveau d’activité de gènes uniques.

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«La capacité à résoudre la dynamique spatiale et temporelle du cycle de transcription, dans un gène, est l’aspect le plus passionnant de ce travail», a déclaré Forero.

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