Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives éthiques et de sécurité pertinentes. Les études ont été menées sous la supervision du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux MD Anderson (protocole n° 00001179). La manipulation des rayonnements a été effectuée sous la supervision du comité de sécurité radiologique MD Anderson (protocole d’utilisateur autorisé 1446).
Réactifs et instrumentation
Les réactifs et les solvants ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific et Sigma-Aldrich, sauf indication contraire, et utilisés sans autre purification. 18F, sous forme de solution aqueuse, et [68Ga]GaCl3 ont été achetés auprès du Center for Advanced Biomedical Imaging Cyclotron Radiochemical Facility (CRF) de MD Anderson. La radioactivité a été mesurée à l’aide d’un calibrateur de dose (Capintec, CRC-15R). 1Main 13La spectroscopie RMN C a été réalisée au MD Anderson Cancer Center sur un spectromètre 500 MHz ou 600 MHz (Bruker) en utilisant le tétraméthylsilane comme référence interne. La spectronomie de masse a été réalisée au MD Anderson Cancer Center sur un spectromètre de masse à chromatographie liquide avec un détecteur ACQUITY TQ (Waters) utilisant l’ionisation par électrospray.
Synthèse du précurseur 2
4-(4,4,5,5-tétraméthyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)naphtalène-1-ol (ChemBridge) (1100 mg, 0,37 mmol) a été dissous dans du dichlorométhane (1,5 ml) et Boc2O (81 mg, 0,37 mmol) et DMAP (45 mg, 0,37 mmol) ont été ajoutés tour à tour. Le mélange a été agité à température ambiante pendant une nuit; le solvant a été éliminé; et le résidu brut a été purifié sur gel de silice (Biotage, % AcOEt dans les hexanes : 0% pour 4 cv, 0% -> 20% dans 5 cv, 20% pour 2 cv). Naphtol protégé 2 (110 mg) a été obtenu sous la forme d’un solide blanc avec un rendement de 80 % (données étendues Fig. 1).
2: 1H RMN (500 MHz, chloroforme-ré) δ 8,84 – 8,76 (m, 1H), 8,08 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 8,00 (dt, J = 8,1, 1,0 Hz, 1H), 7,58 –7,49 (m, 2H), 7,32 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 1,58 (s, 9H), 1,41 (s, 12H). 13C RMN (126 MHz, CDCl3) δ 151,6 (s), 149,6 (s), 138,4 (s), 135,6 (d), 128,6 (d), 126,9 (d), 126,6 (d), 126,0 (s), 121,2 (d), 116,9 (d), 83,8 (s), 83,7 (s), 81,0 (s), 27,8 (q, 3C), 24,9 (q, 4C). MS (ESI) m/avec(% intensité relative) 271 (80), 393 [M + Na]+ (40).
Synthèse de [18F]4FN
Radiosynthèse de [18F]La 4FN a été réalisée sur un module automatique TRACERlab FX FN (GE Healthcare). Aqueux [18F]le fluorure a été adsorbé sur une cartouche échangeuse d’ions (cartouche Sep-PAK Light QMA préconditionnée, ABX). [18F]Le fluorure a été rincé dans le flacon de réaction avec un carbonate de potassium et du Kryptofix 222 eau/CH3Solution de CN (700 μl ; 52,8 mg de K2CO3240,1 mg de K2224 ml d’eau, 16 ml de CH3CN). La solution a été séchée sous vide et sous flux d’azote à 60°C pendant 2 min. CH sec3Du CN (500 μl) a été ajouté et le mélange a été séché par azéotropie à 120 ° C pendant 3 minutes supplémentaires. Synthèse de 4-[18F]le fluoro-1-naphtol a été réalisé en ajoutant du boronate de Boc naphtol 2 (7 mg) et CuOTf2(Py)4 (15 mg, Sigma-Aldrich) dans du DMF sec (600 µl) jusqu’au [18F]fluorure. Le mélange a été agité à 110°C pendant 20 min et refroidi à 80°C, et HCl 1 M (1 ml) a été ajouté. Le mélange a été agité à 80°C pendant 10 minutes, refroidi à 30°C et dilué avec de l’eau (3 ml). Le brut a été purifié par HPLC semi-préparative (colonne Luna 5 µm C18(2), 100 Å, 250 × 10 mm) en éluant avec un mélange 50 % MeCN/eau (0,085 % H3Bon de commande4) phase mobile (température ambiante, 15 min). Le produit radioactif a été recueilli dans le flacon de collecte TRACERlab pré-rempli d’eau (50 ml). La solution a été chargée sur deux cartouches tC2 en série (Sep-PAK, Waters). Les cartouches ont été lavées avec 6 ml d’eau, séchées sous azote et éluées avec de l’éthanol. Le temps de synthèse global était d’environ 70 min. L’activité a été déterminée avec un calibrateur de dose (Capintec, Mirion Technology), et un échantillon a été prélevé pour le contrôle qualité. Le contrôle qualité a été réalisé par radio-HPLC analytique (Agilent 1260 Infinity II) en utilisant une colonne Waters XBridge C18 (3,5 µm, 4,6 × 250 mm ; Méthode : A-eau (0,1 % TFA), B-MeCN (0,1 % TFA) B : 40 % pendant 3 min, 40–95 % en 7 min, 95 % pendant 1 min, débit 1 ml min−1). L’identité du composé radiomarqué a été confirmée par co-élution avec du 4-fluoro-1-naphtol (Toronto Research Chemicals) (Extended Data Fig. 1).
[18F]Test de stabilité 4FN
Pour la stabilité de conservation, [18F]4FN, dans sa formulation finale de 10 % d’éthanol/PBS, a été testé pour la stabilité toutes les heures, jusqu’à 4 h après la formulation. [18F]4FN a été maintenu dans un environnement non inerte à l’air libre pendant la période d’essai. Pour la stabilité du plasma, [18F]4FN a été incubé dans du plasma de souris à 37 ° C pendant 1 h. Les échantillons ont été analysés par radio-HPLC analytique (Agilent 1260 Infinity II) à l’aide d’une colonne Waters XBridge C18 (3,5 µm, 4,6 × 250 mm ; méthode : A-eau (0,1 % TFA), B-MeCN (0,1 % TFA), B : 40 % pendant 3 min, 40–95 % en 7 min, 95 % pendant 1 min, débit 1 ml min−1).
Synthèse de 68Ga-citrate et [18F]FDG
68Ga-citrate a été synthétisé en suivant une procédure de la littérature59. [18F]Le FDG a été obtenu auprès du CRF.
Dosages enzymatiques in vitro
Dans des tubes plastiques autoclavés de 1,5 ml (Eppendorf), [18F]4FN a été incubé avec 0,2 µg de MPO humaine recombinante (Millipore), H2O2 (100 µM) ou les deux dans du PBS 100 µM (Sigma-Aldrich). [18F]4FN a été incubé à 37 ° C pendant 1 h. Les réactions ont été stoppées avec 100 ul d’éthanol glacé et maintenues sur de la glace jusqu’à l’analyse par radio-HPLC. En parallèle, 100 µM de L-012 (Wako) ont été mis à réagir avec les mêmes réactifs le même jour dans des plaques à 96 puits à paroi noire (Corning) pour valider l’activité et la spécificité.
Dans les dosages de radiotraceurs cellulo
Des cellules humaines de leucémie promyélocytaire aiguë HL-60 (American Type Culture Collection, CCL-240) ont été cultivées dans IMDM avec 20 % de FBS. Les cellules HL-60 ont été différenciées en un phénotype de type neutrophile par incubation avec 1 μM d’acide rétinoïque tout-trans (Sigma-Aldrich) dans un milieu de culture pendant 3 jours avant le test. Les cellules ont été transférées du milieu de culture dans des tubes de 0,6 ml contenant 1 million de cellules dans 0,5 ml de MEBSS avec 1 % de sérum de veau bovin le jour de l’essai. Les tubes ont été incubés à 37°C pendant 1 h. Ensuite, 20 μM de 4-ABAH (Cayman Chemical), 10 μM de chlorure de diphénylèneiodonium (Selleck Chemicals) ou un véhicule ont été ajoutés aux tubes, qui ont été laissés à incuber pendant 30 min à 37 ° C. Les cellules ont ensuite été activées avec 1 μM de PMA (Sigma-Aldrich) ou traitées avec un véhicule et incubées pendant 30 minutes supplémentaires à 37 ° C. Tous les tubes ont ensuite été incubés avec 0,169 ± 0,007 μCi de [18F]4FN pendant 30 min à 37 ° C pour permettre l’absorption et la rétention des cellules. La rétention du traceur a été arrêtée en ajoutant 25 µl d’acide trichloroacétique 6,1 N dans les tubes sur de la glace. Les cellules ont été centrifugées à 1 200 tr/min pendant 3 min à 4 ° C et l’espace extracellulaire a été échantillonné pour le comptage de l’activité. Les culots cellulaires ont été lavés avec du MEBSS glacé contenant 1 % de sérum de veau bovin et remis en suspension dans de nouveaux tubes avant centrifugation et lavage à nouveau. Un tampon borate de sodium (10 mM) contenant 1 % de SDS a été ajouté aux culots cellulaires pour permettre la lyse à température ambiante pendant 30 min. Les lysats cellulaires ont été échantillonnés pour le comptage de l’activité, et le lysat restant a été autorisé à se décomposer avant un test BCA pour obtenir la concentration en protéines. Les numérations associées aux cellules et extracellulaires ont été obtenues à l’aide d’un compteur gamma (2480 WIZARD2 Automatic, PerkinElmer). Les données ont été quantifiées comme le rapport des comptes associés aux cellules par milligramme de protéine sur la concentration de radiotraceur dans l’espace extracellulaire.
Imagerie et analyse PET/CT
Pour [18F]Expériences d’imagerie FDG PET/CT, les souris ont été mises à jeun pendant plus de 4 h avant l’injection. Des souris ont reçu une injection intraveineuse sous anesthésie légère avec [18F]FDG (obtenu auprès du CRF chez MD Anderson) puis laisser se réveiller, bouger et boire de l’eau à volonté. De même, mais sans jeûner, les souris ont reçu une injection iv (sauf indication contraire) avec [18F]4FN. Les cages ont été maintenues sur un chauffe-cage pendant la distribution du traceur et les périodes de lavage. Les souris ont été scannées aux moments indiqués après l’injection avec une acquisition PET/CT de 10 minutes (Albira, Bruker) en utilisant un champ de vision de 15 cm (FOV) ; Les images CT ont été acquises pour la fusion à l’aide d’un FOV de 7 cm, étagées et cousues si nécessaire. La reconstruction TEP a été réalisée par MLEM 3D, 12 itérations, avec correction de décroissance, aléatoire et de dispersion appliquée à des voxels isotropes de 500 μm. La tomodensitométrie est reconstruite avec une rétroprojection filtrée et des voxels isotropes de 500 μm. Le système TEP préclinique du centre d’imagerie MD Anderson pour petits animaux comprend un contrôle de qualité quotidien avec des fantômes d’inondation ainsi qu’au moins un entretien préventif annuel, y compris un étalonnage quantitatif. La dose injectée réelle a été calculée sur la base de la mesure de l’activité pré- et post-injection dans la seringue avec un calibrateur de dose (Capintec), et les souris ont été pesées individuellement pour les images statiques. Les données d’image ont été corrigées en fonction du temps d’injection (Albira, Bruker) et corrigées pour la dose individuelle injectée (%ID/cc) et, le cas échéant, normalisées au poids de l’animal, exprimées en SUV (g/cc) (PMOD, PMOD Technologies) . Pour les images dynamiques, les souris ont été injectées sur le système d’imagerie, et %ID/cc a été calculé sur une base par souris à partir de l’activité de la souris entière dérivée de l’image.
Modèles d’inflammation in vivo
Une inflammation du corps entier a été induite chez des souris femelles C57Bl6/N avec du LPS (Escherichia coli055:B5 Ultrapure, InvivoGen) injection, 20 mg kg−1 ip, et par rapport au contrôle salin. Quatre heures plus tard, les souris ont été imagées avec [18F]4FN ou 68Ga-citrate comme ci-dessus et euthanasié avant l’apparition des principaux symptômes.
L’arthrite aiguë a été induite avec du LPS intra-articulaire (20 µg dans 20 µl de solution saline) chez des souris femelles C57Bl6/N (Taconic) ; l’injection de solution saline a servi de témoin. Vingt-quatre heures plus tard, des souris aux chevilles visiblement enflammées ont reçu une injection de [18F]4FN iv et scanné en continu pendant 1 h avec PET en mode liste. Les images ont été reconstruites et les TAC PET/CT ont été quantifiés. Le même jour, des souris ont reçu une injection de sel de sodium L-012 dans une solution saline (20 mg kg−1 ip) et imagé en mode bioluminescence et réflectance 10 min après injection sur un système d’imagerie bioluminescence/rayons X (Xtreme, Bruker). Les images ont été acquises avec un FOV de 19 cm, f/1.1, binning 4 × 4, 243 s ou 4 min. Les souris ont ensuite été euthanasiées et les chevilles ont été récoltées, fixées, décalcifiées et colorées avec H&E (Histochemistry Core, MD Anderson).
Pour induire une dermatite de contact aiguë, des souris adultes femelles C57Bl6/N (Taconic) ou femelles BALB/cN (BALB/cAnNTac, Taconic) (âgées de 20 à 30 semaines) ont été traitées par voie topique avec du PMA (Sigma-Aldrich, 400 µM, éthanol) sur l’oreille droite ou véhicule (éthanol) sur l’oreille gauche. Vingt-quatre heures plus tard, les souris ont reçu une injection de [18F]4FN ou [18F]FDG comme indiqué et imagé.
Femme Cyb−/− souris (également appelées Nox2−/−) et MPO−/− les souris ont été obtenues auprès de Jackson Laboratories et comparées à des souris C57Bl6 / J de même souche et âge, également de Jackson Laboratories.
Résumé des rapports
De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.
