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Traçage viral à code-barres des interactions unicellulaires dans l’inflammation du système nerveux central

by Les Actualites

Analyse monocellulaire des interactions du SNC

Malgré leur importance dans la physiologie et la pathologie du système nerveux central (SNC), peu de méthodes sont disponibles pour l’étude systématique et impartiale des interactions de cellule à cellule à une résolution de cellule unique. Clark et coll. a développé RABID-seq, une méthode qui combine le traçage viral à code-barres avec le séquençage d’ARN unicellulaire (voir la perspective de Silvin et Ginhoux). RABID-seq a identifié les molécules de guidage axonales Sema4D-PlexinB2 et EphrinB3-EphB3 comme médiateurs des interactions microglie-astrocytes qui favorisent la pathologie du SNC dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale et, potentiellement, la sclérose en plaques. Ces études ont également identifié des molécules thérapeutiques candidates pour la modulation des interactions microglies-astrocytes dans la sclérose en plaques.

La science, ce numéro p. eabf1230; voir aussi p. 342

Résumé structuré

INTRODUCTION

Les cellules gliales du système nerveux central (SNC), y compris les astrocytes et la microglie, jouent un rôle essentiel dans le développement, la réparation des tissus et l’homéostasie. Cependant, les réponses dérégulées des astrocytes et des microglies contribuent à la pathogenèse des maladies neurologiques. En effet, il a été démontré que les produits chimiques environnementaux, les métabolites microbiens et les interactions cellule-cellule modulent les réponses favorisant la maladie dans les astrocytes et la microglie dans le contexte de la sclérose en plaques (SEP) et de son modèle, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). En particulier, bien que les interactions astrocytes avec la microglie soient connues pour jouer un rôle important dans la pathologie de la SEP et d’autres maladies neurologiques, les voies qui facilitent la diaphonie astrocyte-microglie sont mal comprises et, par conséquent, peu d’inventions thérapeutiques sont disponibles pour les cibler.

RAISONNEMENT

Comprendre la complexité de la diaphonie astrocyte-microglie dans l’inflammation du SNC nécessite l’étude d’interactions neuro-immunes précises in vivo, mais les méthodologies pour définir les types de cellules spécifiques, les voies et les molécules qui interviennent dans ces interactions sont limitées. Nous avons développé une méthode de code à barres basée sur le virus pour l’identification de milliers d’interactions cellulaires du SNC in vivo et l’analyse simultanée du transcriptome de cellules en interaction avec une résolution monocellulaire. Nous avons appliqué cette technique, appelée détection d’interaction de code-barres de la rage suivie d’un séquençage (RABID-seq), à l’étude de la communication microglie-astrocyte dans le contexte de l’inflammation du SNC dans l’EAE et la SEP.

RÉSULTATS

Pour développer RABID-seq, nous avons conçu une bibliothèque à code-barres d’ARNm dans le virus de la pseudorage à déficit en glycoprotéine G (RabΔG-BC), qui se propage entre les cellules en interaction mais ne peut se répliquer que dans les cellules qui expriment de manière transgénique la glycoprotéine virale G. Nous avons pseudotypé le RabΔG-BC bibliothèque de plasmides utilisant la protéine d’enveloppe de l’empaquetage du sous-groupe A (EnvA). Ainsi, le virus pseudotypé infecte uniquement les cellules qui expriment de manière transgénique le récepteur EnvA, TVA. Après sa réplication dans des cellules qui expriment la TVA et la glycoprotéine virale G, RabΔG-BC infecte les cellules en interaction, les marquant avec le code à barres codé par le virus. Pour étudier les interactions astrocytaires RABID-seq in vivo au cours de l’inflammation du SNC dans le modèle EAE de la SEP, nous avons utilisé des souris transgéniques exprimant la glycoprotéine G et la TVA dans les astrocytes sous le contrôle de la Gfap promoteur. Ces études ont identifié plusieurs molécules de guidage axonales comme médiateurs critiques des interactions microglies-astrocytes dans le contexte de l’inflammation. En combinant RABID-seq avec des études de perturbation génétique in vivo, la validation avec des cellules primaires de souris et humaines in vitro et l’analyse d’échantillons de patients atteints de SEP par immunocoloration et ARN-seq unicellulaire, nous avons établi que les interactions microglies-astrocytes médiées par Sema4D- PlexinB1, Sema4D-PlexinB2 et Ephrin-B3-EphB3 favorisent la pathologie du SNC dans l’EAE – et potentiellement la SEP. Notamment, Ephrin-B – EphB3 a participé à la signalisation directe et inverse, qui a stimulé à la fois les activités pathogènes de la microglie et des astrocytes via la régulation du facteur nucléaire κB et de la cible mammifère de la rapamycine, respectivement. Enfin, nous avons démontré qu’un inhibiteur de petites molécules pénétrant dans le SNC de l’activité kinase du domaine intracellulaire EphB3 améliore l’EAE dans les modèles progressifs aigus et chroniques.

CONCLUSION

Nous avons développé RABID-seq, une nouvelle approche pour l’étude simultanée des interactions cellulaires et du transcriptome des cellules en interaction in vivo avec une résolution monocellulaire. RABID-seq a identifié des voies de signalisation contrôlées par les molécules de guidage axonales Sema4D-PlexinB1, Sema4D-PlexinB2 et Ephrin-B3 / EphB3 en tant que médiateurs des interactions microglie-astrocytes qui favorisent la pathogenèse du SNC et également en tant que cibles candidates pour une intervention thérapeutique dans les troubles neurologiques.

Elucidation des interactions microglie-astrocytes par détection d’interaction de code-barres de la rage suivie d’un séquençage (RABID-seq).

Virus de la rage pseudotypé exprimant des cibles d’ARNm à code-barres Gfap+ astrocytes, où il se réplique avant d’infecter les cellules voisines, laissant une trace de code-barres. Le séquençage d’ARN monocellulaire lit à la fois les ARNm cellulaires et les codes-barres viraux, permettant la reconstruction des interactions cellulaires in vivo et l’analyse transcriptionnelle des cellules en interaction avec une résolution monocellulaire.

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Elucidation des interactions microglie-astrocytes par détection d’interaction de code-barres de la rage suivie d’un séquençage (RABID-seq).

Virus de la rage pseudotypé exprimant des cibles d’ARNm à code-barres Gfap+ astrocytes, où il se réplique avant d’infecter les cellules voisines, laissant une trace de code-barres. Le séquençage d’ARN monocellulaire lit à la fois les ARNm cellulaires et les codes-barres viraux, permettant la reconstruction des interactions cellulaires in vivo et l’analyse transcriptionnelle des cellules en interaction avec une résolution monocellulaire.

Abstrait

Les interactions cellule-cellule contrôlent la physiologie et la pathologie du système nerveux central (SNC). Pour étudier les interactions cellulaires astrocytaires in vivo, nous avons développé la détection des interactions de codes-barres de la rage suivie d’un séquençage (RABID-seq), qui combine le traçage viral à code-barres et le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq). En utilisant RABID-seq, nous avons identifié des molécules de guidage axonales comme médiateurs candidats des interactions microglie-astrocytes qui favorisent la pathologie du SNC dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) et, potentiellement, la sclérose en plaques (SEP). Les études EAE de perturbation génétique spécifique aux cellules in vivo, les systèmes in vitro et l’analyse des ensembles de données MS scRNA-seq et des tissus du SNC ont établi que Sema4D et Ephrin-B3 exprimés dans la microglie contrôlent les réponses des astrocytes via la PlexinB2 et l’EphB3, respectivement. En outre, un inhibiteur de l’EphB3 pénétrant dans le SNC a supprimé les réponses pro-inflammatoires des astrocytes et des microglies et amélioré l’EAE. En résumé, RABID-seq a identifié des interactions microglies-astrocytes et des cibles thérapeutiques candidates.

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