Publié le 2024-02-29 10:00:00. Des chercheurs ont mis au point un protocole précis de préparation d’échantillons embryonnaires pour l’immunohistochimie fluorescente, une technique d’analyse cruciale pour l’étude du développement cardiaque et neurologique.
- Le processus implique une fixation, une déshydratation, une inclusion en paraffine et une coupe des échantillons à l’aide d’un microtome.
- Une étape de démasquage des antigènes est réalisée pour optimiser la liaison des anticorps.
- Plusieurs anticorps spécifiques sont utilisés pour identifier des protéines clés impliquées dans le développement cardiaque et neuronal.
L’immunohistochimie fluorescente est une technique largement utilisée en biologie du développement pour visualiser la localisation et l’expression de protéines spécifiques dans les tissus. La préparation adéquate des échantillons est essentielle pour obtenir des résultats fiables et interprétables. Le protocole décrit ici détaille les différentes étapes nécessaires à la préparation d’embryons pour cette technique, depuis la fixation initiale jusqu’au montage des lames pour l’observation au microscope.
Les chercheurs ont commencé par disséquer les embryons et les fixer pendant la nuit dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % (ChemCruz, SC-281692). Après un lavage rapide dans du tampon phosphate salin (PBS, Gibco, 18912-014), les échantillons ont été progressivement déshydratés en les immergeant dans une série de solutions d’éthanol de concentrations croissantes (70 %, 80 %, 90 %, 96 %, puis deux bains de 100 %, Sigma-Aldrich, 32221-2,5 LM). Cette déshydratation permet de préparer les tissus à l’inclusion en paraffine.
L’étape suivante consiste à imprégner les échantillons en paraffine (Paraplast plus, Sigma-Aldrich, P3683) en les incubant à 65 °C dans du 1-butanol (MP Biomedicals, 194001) pendant la nuit, suivie de trois bains de paraffine de deux heures chacun. La paraffine permet de solidifier les tissus et de les rendre aptes à être coupés en fines tranches.
À l’aide d’un microtome Leica (Microm HM325), des coupes de 10 μm d’épaisseur ont été réalisées et déposées sur des lames de verre Superfrost Plus (VWR, 631-0108), en veillant à ce que chaque coupe contienne une section du cœur. Les lames ont ensuite été séchées toute la nuit à 33 °C.
Avant l’immunomarquage, les lames ont été déparaffinées au xylène (Fisher Scientific, X/0200/17) pendant deux périodes de cinq minutes, puis réhydratées en les immergeant dans une série de solutions d’éthanol de concentrations décroissantes (100 %, 96 %, 90 %, 80 %, 70 %) pendant une minute chacune, suivie d’une minute dans du PBS. Les échantillons ont ensuite été soumis à un traitement de démasquage des antigènes en étant bouillis pendant quatre minutes dans une cocotte minute, en utilisant une solution spécifique (H-3300, Vector Laboratories). Ce traitement permet de rendre les antigènes plus accessibles aux anticorps.
Un cercle a été tracé autour des échantillons à l’aide d’un stylo ImmEdge (Vector Laboratories, H4000) pour confiner les réactifs. Les coupes ont ensuite été bloquées pendant 30 minutes à température ambiante dans une chambre humidifiée, en utilisant un mélange contenant de la poudre de réactif de blocage (0,5 %, Akoya Bioscience, FP1012), du chlorure de sodium (0,15 M) et du Tris-HCl (0,1 M, pH 7,5). Le blocage permet de réduire la liaison non spécifique des anticorps.
Les lames ont ensuite été incubées avec un anticorps primaire dilué dans la solution de blocage pendant une nuit à température ambiante. Après trois lavages de cinq minutes dans du PBS contenant du Tween-20 (PBS-T, Chemcruz, sc-29113), un anticorps secondaire a été appliqué pendant deux heures à température ambiante (dilution 1:200 dans la solution de blocage, Invitrogen, gamme Alexa).
Pour les anticorps dirigés contre les protéines Slit et Robo, une étape d’amplification du signal a été ajoutée en utilisant le kit TSA (NEL756001KT, Perkin et Elmer). Au lieu d’un anticorps secondaire Alexa, un anticorps secondaire biotinylé a été utilisé (dilution 1:200 dans la solution de blocage, incubation de 45 minutes à température ambiante), suivi de trois lavages dans du PBS-T et d’une incubation de 30 minutes avec de la streptavidine-peroxydase de radis conjuguée (Vector Laboratories, SA-5004). Le signal a ensuite été amplifié par l’ajout de fluorescéine ou de tétraméthylrhodamine (diluées au 1:100 dans un tampon d’amplification, NEL756001KT) pendant trois minutes, suivi de trois lavages dans du PBS et d’une coloration au DAPI (2,5 µg/ml, Sigma, MBD0015). Enfin, les lames ont été montées avec du Mowiol 4–88 (Applichem, A9011,1000) et durcies à 37 °C dans l’obscurité.
Les anticorps primaires utilisés ciblaient les protéines suivantes : troponine I cardiaque (cTnI, 1:200, Hytest Ltd, 4T21/2), chaîne lourde de myosine (MF20, 1:50, HSHB, AB-2147781), périphérine (Prph, 1:200, Millipore, AB1530), tyrosine hydroxylase (TH, 1:200, Millipore, AB152), Robo1 (1:200, Systèmes R&D, AF1749), Robo2 (1:200, Systèmes R&D, AF3147), Slit2 (1:200, Systèmes R&D, AF5444), Slit3 (1:200, R&D Systems, MAB3629), Erg1 (1:200, Abcam, ab110639) et chaîne lourde 11 de myosine de muscle lisse (Myh11, 1:200, Abcam, ab125884). L’imagerie a été réalisée sur un microscope Nikon (Nikon, Eclipse Ci-L) et les images ont été traitées avec ImageJ pour créer des combinaisons de couleurs magenta et verte (Schneider et coll., 2012).
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